彌散性血管內(nèi)凝血動物模型

彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)是臨床上一種獲得性綜合征，它可由各種不同的原因引發(fā)。臨床上DIC主要表現(xiàn)為由微血管血栓形成和栓塞引起的多臟器功能障礙、出血、休克和微血管病性溶血性貧血。 DIC代表了臨床病理的一系列連續(xù)的嚴(yán)重表現(xiàn)，其主要特征是血管內(nèi)凝血機(jī)制激活后，其局限性或代償性控制進(jìn)行性喪失。DIC的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，許多影響因素至今仍未闡明。無論在何種原發(fā)病或何種因素誘導(dǎo)下發(fā)生 DIC，機(jī)體凝血系統(tǒng)活化均既存在順序性級聯(lián)反應(yīng)的特征，也存在正、負(fù)反饋使凝血反應(yīng)放大或受到限制的特征。 DIC時通常顯示纖維蛋白分布在多種器官中，是導(dǎo)致器官功能衰竭的原因?？鼓委熓亲钄郉IC病理過程的重要措施之一，其目的在于抑制廣泛性微血栓形成的病理過程，防止血小板及各種凝血因子進(jìn)一步消耗。為恢復(fù)其正常含量、重建正常的凝血與抗凝血平衡創(chuàng)造條件。因此，建立理想的 DIC動物模型，用于實(shí)驗(yàn)研究非常重要。

1 高分子右旋糖酐誘導(dǎo)大鼠彌散性血管內(nèi)凝血模型

(1)復(fù)制方法  體重為250～400g、10月齡雄性Wistar大鼠。按30mg/kg體重的劑量經(jīng)腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部皮膚常規(guī)消毒與去毛。無菌手術(shù)暴露頸動脈、靜脈，分別插管。用130g/L高分子右旋糖酐(分子量為480000)按15ml/kg體重的劑量經(jīng)頸靜脈注射，1min或3min注完。于給藥*min及給藥后10、20、30min進(jìn)行微循環(huán)觀察，經(jīng)顯微電視錄像觀察回腸下段腸系膜血管(包括一二級微動脈和一二級微靜脈)流態(tài)以及微血流流態(tài)、血細(xì)胞聚集情況；給藥后30min時，經(jīng)模型大鼠頸動脈取血作相關(guān)凝血功能指標(biāo)的檢測，并進(jìn)行血漿魚精蛋白副凝試驗(yàn)(3R試驗(yàn))；主要觀察指標(biāo)：模型大鼠微循環(huán)積分值、全血黏度、血漿黏度、相對黏度、血小板黏附率和聚集率、血小板計(jì)數(shù)、血漿凝血酶原時間、纖維蛋白原水平、裂體細(xì)胞檢查。注射后30min麻醉處死大鼠，分別取其肺、腎、心等組織經(jīng)10％甲醛溶液固定后，作常規(guī)組織切片，HE染色，光鏡下形態(tài)學(xué)觀察。

(2)模型特點(diǎn)  模型動物微血管流態(tài)變化突出，注射高分子右旋糖酐后流速變慢、血細(xì)胞淤滯、聚集、微血流呈粒緩流，出現(xiàn)嚴(yán)重的微循環(huán)障礙。用田牛氏微循環(huán)加權(quán)積分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算流態(tài)積分值，發(fā)現(xiàn)模型大鼠流態(tài)積分值明顯高于實(shí)驗(yàn)前和正常對照動物，這些變化細(xì)動脈比細(xì)靜脈更明顯。造模后，模型動物血小板黏附率、聚集率明顯增強(qiáng)，血小板計(jì)數(shù)顯著減少，凝血酶原時間延長，纖維蛋白原降低，與正常動物相比有顯著性差異；模型動物3R試驗(yàn)均為陽性。鏡下病理組織學(xué)觀察顯示：模型大鼠可見纖維索性血栓和混合血栓，尤以肺內(nèi)多見，其血涂片可見大量裂體細(xì)胞。本方法復(fù)制的大鼠DIC模型屬于急性型，其特點(diǎn)為凝血因子的消耗性減少、繼發(fā)纖溶系統(tǒng)的亢進(jìn)、血液流變學(xué)和微循環(huán)的明顯障礙。本模型制作方法簡便，應(yīng)用范圍廣，效果穩(wěn)定。

(3)比較醫(yī)學(xué)  本模型的致病機(jī)制是當(dāng)靜脈注射高分子右旋糖酐后，模型大鼠微血流積分值升高，血流變慢；血液流動性的異常，導(dǎo)致了機(jī)體血管舒縮功能的紊亂，為DIC的發(fā)生創(chuàng)造了條件，此時無論血管收縮、血流減少，還是血管舒張、血流淤滯，都不利于促凝物質(zhì)和活化凝血因子從局部清除，而有利于纖黏蛋白(FN)在局部沉降。此外注射高分子右旋糖酐后模型動物的血黏度、血漿黏度、血小板黏附和聚集性均明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致機(jī)體血液動力學(xué)出現(xiàn)異常。由于血液動力學(xué)異常和血流阻力的變化密切相關(guān)，當(dāng)血黏度增高時，血流阻力明顯加大，其直接的結(jié)果就是造成微循環(huán)的明顯障礙，導(dǎo)致組織細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞的損害，進(jìn)而加重微循環(huán)障礙，如此惡性循環(huán)推動模型動物DIC的進(jìn)展。本模型的疾病特征與臨床患者的DIC類似，適用于DIC藥物治療和藥物篩選方面的實(shí)驗(yàn)研究。

2 脂多糖誘導(dǎo)兔彌散性血管內(nèi)凝血模型

(1)復(fù)制方法  體重2kg左右雄性新西蘭兔，按30mg/kg體重的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將兔仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部皮膚常規(guī)消毒與去毛。頸部正中無菌手術(shù)作一切口，鈍性分離左側(cè)頸總動脈，結(jié)扎動脈遠(yuǎn)心端，用18G靜脈插管針穿刺并固定，以備留取標(biāo)本用。按2.5mg/kg體重的劑量經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢注入脂多糖(lipopolysaccharide)，分2次注射給藥，間隔1h，每次脂多糖注射時間約為10min。注射脂多糖前及注射后2、4、6h分別采取兔血作活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原、血小板計(jì)數(shù)、抗凝血酶Ⅲ、血清纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)檢測。并于造模結(jié)束時麻醉處死動物，取心、肺、腎、脾與肝組織，用10％甲醛溶液固定，作常規(guī)組織切片，HE染色，光鏡下觀察。

(2)模型特點(diǎn)  注射脂多糖后，模型兔活化部分凝血活酶時間明顯延長，血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原顯著降低，抗凝血酶Ⅲ活性明顯下降，血清FDP無明顯變化。鏡下病理組織學(xué)觀察顯示，模型兔的心、肝、肺、腎、脾臟均可見微血栓形成，肺組織中尚有大量炎癥細(xì)胞浸潤。

(3)比較醫(yī)學(xué)  DIC是一種彌散而隱匿的血管內(nèi)血液凝固現(xiàn)象，它可導(dǎo)致機(jī)體凝血因子不斷消耗，臨床上可造成患者廣泛出血。本模型制作過程中，當(dāng)注射脂多糖后兔的靜脈穿刺部位有滲血，30min時動物出現(xiàn)呼吸頻率明顯增快、紫紺，血小板數(shù)量呈進(jìn)行性降低，APTT明顯延長；鏡下病理組織學(xué)觀察心、肺、肝、腎、脾組織內(nèi)均有纖維蛋白血栓形成，證實(shí)靜脈注射脂多糖可成功復(fù)制兔DIC模型。但模型動物血FDP無明顯改變，表明脂多糖引起的DIC以消耗性凝血為主，纖溶活性改變不大；同時模型動物注射脂多糖后2、4、6h后APTT均顯著延長，提示脂多糖誘發(fā)DIC過程中機(jī)體內(nèi)源性凝血途徑被啟動，此時體內(nèi)可通過外源性和內(nèi)源性途徑生成凝血酶，后者有廣泛的促凝血和促血栓形成作用。本方法復(fù)制的DIC模型顯示纖維蛋白分布在多種器官中，可導(dǎo)致模型動物發(fā)生多器官功能衰竭，模型DIC表現(xiàn)與臨床上人類發(fā)生的DIC相似，可用于DIC發(fā)病機(jī)制及藥物篩選方面的實(shí)驗(yàn)研究。